Hijo de un matrimonio mixto; la madre, que evidentemente lo instruyó en las Escrituras, era judía, y el padre griego (Hch. 16.1; 2 Ti. 1.5). Era nativo de Listra (Hch. 16.1), y altamente estimado por sus hermanos cristianos tanto allí como en Iconio (Hch. 16.2). No se especifica cuando se hizo cristiano, pero resulta razonable inferir que fue convertido por Pablo en su primer viaje misionero, en el que estaba incluida Listra, y que en esa ocasión fue testigo de los sufrimientos de Pablo (2 Ti. 3.11). No se sabe con seguridad cuándo se hizo cristiana su madre Eunice; tal vez antes que Timoteo mismo, pero por cierto que antes del segundo viaje misionero de Pablo.
El apóstol sentía una gran simpatía para con el joven Timoteo, y aun cuando hacía poco que había remplazado a Bernabé por Silas como compañero de viaje, apregó a Timoteo a la partida, quizá como sustituto de Juan Marcos, al que se había negado a aceptar (Hch. 15.36s). Esta elección parece haber sido apoyada por otros, porque Pablo más tarde se refiere a manifestaciones proféticas que confirmaron el que Timoteo debía ser apartado para esta obra (1 Ti. 1.18; 4.14). En ese momento habría recibido una dotación especial para su misión, comunicada mediante la imposición de manos de los ancianos y Pablo (1 Ti. 4.14; 2 Ti. 1.6). Para aquietar cualquier oposición innecesaria por parte de los judíos del lugar, Timoteo fue circuncidado antes de iniciar sus viajes.
Primeramente se le encomendó una misión especial a Tesalónica, con el fin de alentar a los cristianos que estaban siendo perseguidos. Se lo asocia con Pablo y Silvano en los saludos en las dos epístolas enviadas a dicha iglesia, y estuvo presente con Pablo durante su misión de predicación en Corinto (2 Co. 1.19). Se lo vuelve a mencionar durante el ministerio del apóstol en Éfeso, cuando fue enviado con Erasto a cumplir otra misión importante en Macedonia, de donde debía seguir viaje a Corinto (1 Co. 4.17). Timoteo era de carácter tímido, evidentemente, porque Pablo insta a los corintios a que contribuyan a que se sienta cómodo y a no despreciarlo (1 Co. 16.10–11; 4.17ss). Por la situación que se suscitó en Corinto (véase 2 Co.) se ve que la misión de Timoteo no tuvo éxito, y resulta significativo que, aun cuando su nombre estaba asociado con el de Pablo en los saludos de esta epístola, es Tito y no Timoteo el que ocupa el lugar de delegado apostólico. Acompañó a Pablo en el otro viaje a Corinto, porque estaba con él como colaborador cuando se escribió la epístola a los Romanos (Ro. 16.21).
Timoteo fue, también, en el viaje de Pablo a Jerusalén con la ofrenda (Hch. 20.4–5), y se lo vuelve a mencionar cuando Pablo, ya prisionero, escribió Colosenses, Filemón, y Filipenses. En esta última epístola es calurosamente elogiado, Pablo se propone mandarlo pronto a visitarlos, con el fin de asegurarse de su bienestar espiritual. Cuando el apóstol fue liberado de la prisión y encaró nuevas actividades misioneras en el Este, como lo indican las epístolas pastorales, parecería que Pablo dejó a Timoteo en Éfeso (1 Ti. 1.3) y le encomendó que se ocupara de los falsos maestros y supervisara el culto público y la designación de autoridades en la iglesia. Si bien Pablo evidentemente esperaba poder reunirse con Timoteo, el temor de que pudiera verse demorado lo movió a escribirle la primera carta, y esta fue seguida por otra cuando Pablo no sólo fue arrestado nuevamente sino que estaba siendo juzgado, con peligro de tener que enfrentar una sentencia de muerte. Timoteo recibió el encargo de apresurarse a ir a su encuentro, pero no es posible determinar si llegó a tiempo o no. Más tarde Timoteo mismo fue hecho prisionero, como lo demuestra He. 13.23, pero no se dan detalles, y no se sabe nada concreto en cuanto a lo que le ocurrió posteriormente.
Era un hombre afectuoso (2 Ti. 1.4) pero muy temeroso (2 Ti. 1.7ss), que necesitó más de una admonición de parte de su padre espiritual; se le advierte que no debe dar lugar a los deseos juveniles (2 Ti. 2.22), y que no debe avergonzarse del evangelio (2 Ti. 1.8). Sin embargo, ninguno de los otros compañeros de Pablo es elogiado tan calurosamente por su lealtad (1 Co. 16.10; Fil. 2.19ss; 2 Ti. 3.10ss). Resulta apropiado que la carta final escrita por el apóstol fuese dirigida tan afectuosamente a este sucesor casi renuente, cuyas debilidades son tan evidentes como sus virtudes.